Sviluppo di un sistema microfluidico per riprodurre le caratteristiche fisiologiche del pancreas esocrino = Development of an organ-on-chip model to mimic exocrine pancreas

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è la quarta delle principali cause di decessi correlati al cancro in tutto il mondo; è il tipo più letale di cancro del pancreas a causa dell'elevata resistenza del PDAC ai trattamenti (dovuta anche al microambiente tumorale), alla diagnosi tardiva, alla diffusione rapida delle metastasi. Per studiare il microambiente tumorale, la sua influenza sulle terapie e sulla crescita tumorale, per sviluppare farmaci sicuri ed efficaci, per comprendere l'influenza del crosstalk tra componenti cellulari tumorali, i modelli in vitro risultano strumenti utili e potenti. In questo lavoro di tesi, un modello di organ-on-chip è stato implementato per ricreare l'unità acino-duttale in vitro; il dispositivo microfluidico realizzato in PDMS presenta una struttura a tre strati: un reservoir per il mezzo di coltura, un top layer utilizzato per la semina delle cellule epiteliali pancreatiche del dotto umano (HDPE) e un bottom layer, per la semina dei fibroblasti del prepuzio umano (HFF-1). Gli strati sono stati realizzati con la tecnica della replica moulding, ed è stato progettato uno stampo per ogni layer, realizzati con tecniche di fabbricazione diverse: per lo strato inferiore è stato scelto il processo di soft lithography, con resist SU-8, mentre per lo strato superiore e reservoir è stata utilizzata la tecnica di stampa 3D. Gli top e bottom layer sono separati da una membrana microporosa elettrofilata, costituita da policaprolattone e gelatina (PCL / Gel), che divide il canale centrale inferiore, riempito con idrogel di collagene che imita la componente stromale, e il canale superiore, dove le cellule seminate riproducono la componente cellulare tumorale. Ogni componente del dispositivo microfluidico è stato caratterizzato con vari tests: per le repliche PDMS è stata eseguita la caratterizzazione morfologica, con microscopia ottica, mentre per la caratterizzazione morfologica della membrana è stata scelta la microscopia elettronica a scansione ad emissione di campo (FESEM); per lo studio della diffusione su membrana, è stato eseguito il test di permeabilità utilizzando fluoresceina isotiocianato-destrano (FICT-destrano) e soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), quindi i valori letti sono stati analizzati utilizzando Excel. La proliferazione cellulare e la vitalità sul chip microfluidico sono state testate utilizzando diverse linee cellulari e diverse condizioni di coltura: le cellule HDPE sono state seminate solo sullo top layer e la vitalità è stata testata utilizzando il metodo di staining cellulare e osservazione con microscopia in fluorescenza, mentre le cellule HFF-1 sono state seminate solo sul bottom layer, sospendendole nell'idrogel di collagene, e per il test di vitalità è stato effetuato il saggio live/dead e il metodo di staining cellulare e osservazione con microscopia in fluorescenza. Il dispositivo assemblato è stato testato utilizzando la co-coltura di cellule HFF-1 e HDPE e la vitalità è stata valutata utilizzando un colorante cellulare, per HFF-1, e il metodo di staining cellulare e osservazione con microscopia in fluorescenza, per l'HDPE. Inoltre, la microscopia ottica è stata utilizzata per osservare le cellule prima e dopo la semina. I risultati suggeriscono che le cellule HFF-1 sono vitali nel collagene hydrogel per l'intero periodo di coltura e che presentano la caratteristica forma allungata attiva; le cellule HDPE possono aderire sulla membrana PCL / Gel e possono anche proliferare su di essa.