Caratterizzazione termica e citotossicità di eccipienti per liofilizzazione e applicazioni in vitro = Thermal and cytotoxicity characterization of excipients for lyophilization and in vitro applications

La liofilizzazione è una tecnica di conservazione largamente utilizzata in ambito farmaceutico con cui è possibile stabilizzare diverse classi di prodotti per uso nanotecnologico e biomedicale. Molti prodotti farmaceutici, richiedono l’utilizzo di diversi tipi di eccipienti per evitare danni ai principi attivi durante il processo e ottenere prodotti sicuri ed efficaci. Nell’ambito di questa tesi sono stati studiati alcuni degli eccipienti più diffusi (mannitolo, glicina, destrano, cellobiosio, trealosio, isoleucina, metionina, glicole polietilenico (PEG), lattosio, saccarosio e (2-idrossipropil)-β-ciclodestrina) dal punto di vista del comportamento termico, durante la liofilizzazione e dell’effetto biologico in un modello in vitro, costituito da una linea cellulare sana, i linfociti B, e una cancerosa, le Daudi. In particolare, sono state studiate diverse concentrazioni di eccipienti diluiti in acqua bidistillata a 100, 10 e 1 mg/ml. L’analisi termica è stata effettuata tramite calorimetria differenziale a scansione (DSC) e crio-microscopio (FDM). L’analisi FDM ha evidenziato che in soluzioni molto diluite, a partire da 1 mg/ml, non vi è la formazione di una struttura solida liofilizzata: A partire da temperature molto basse vi è il distacco del materiale essiccato senza formazione di matrice solida che, pertanto, tende ad essere trasportato dal flusso di vapore. A seguito del processo di liofilizzazione, le soluzioni più concentrate hanno portato all’ottenimento di strutture compatte che in alcuni casi presentavano caratteristiche particolari quali disomogeneità. Le soluzioni con concentrazione di 100 o 10 mg/ml sono risultate accettabili, con valori di umidità residua, effettuata tramite titolazione Karl Fischer, inferiori al 2%, ad eccezione di quelle contenenti glicole polietilenico che non hanno formato una matrice solida a valle del processo. Dopo la ricostituzione, il comportamento in cellula dei prodotti liofilizzati è stato valutato tramite saggio di proliferazione WST-1. Dall’analisi risulta che non ci sono differenze significative né valutando la linea cellulare né la diversa durata del trattamento. Considerando invece le diverse concentrazioni di eccipienti, i trattamenti a 100 mg/ml hanno dimostrato in generale una vitalità inferiore rispetto a quelli a 10 e 1 mg/ml, indipendentemente dall’eccipiente esaminato. In questo contesto spicca il comportamento del destrano che, nel trattamento di più breve durata delle cellule sane, non ha comportato variazioni di vitalità rispetto ai controlli a nessuna delle tre concentrazioni studiate. Degno di nota anche l’esito delle prove effettuate in cellula con gli amminoacidi, isoleucina, glicina, e metionina, in quanto, sia per i trattamenti brevi che per quelli più lunghi, la loro aggiunta ha avuto un impatto significativamente peggiore sulla vitalità delle cellule tumorali, cosa che potrebbe risultare vantaggiosa per terapie oncologiche. Dalle analisi effettuate in presenza di PEG è emerso che questo non riduce significativamente la vitalità delle cellule sane, se sottoposte a un trattamento breve, indipendentemente dalla sua concentrazione.