Cristallizzazione di lisozima in gel di silice = Crystallization of lysozyme in silica gel

La cristallizzazione di proteine e’ una tecnica utile sia in ambito industriale che di ricerca, nella quale e’ impiegata nello studio della morfologia e funzione biologica di queste macromolecole. Negli anni ha assunto una grande importanza la tecnica di cristallizzazione in matrice gel, che ha il vantaggio di impedire i moti convettivi delle molecole per cui il loro trasporto da bulk a cristallo e’ unicamente di tipo diffusivo. Nel presente lavoro di Tesi sperimentale si è utilizzata la tecnica in gel di silice ottenuto da tetrametossisilano (TMOS), applicandola al lisozima da albume d’uovo di gallina (Hen Egg White Lysozyme, HEWL). Il TMOS ha il significativo vantaggio di non richiedere un riscaldamento per la transizione sol-gel, ma presenta alcuni forti svantaggi: produzione di metanolo come sottoprodotto, che favorisce la solubilità delle proteine, e inibizione della cristallizzazione per la forte affinita’ tra la matrice gel e la proteina. Per arginare quest’ultimo fenomeno e’ stato studiato l’effetto di alcuni additivi capaci di legarsi ai gruppi -OH liberi sulla superficie del gel, responsabile dei legami idrogeno con le macromolecole proteiche. L’obiettivo delle attività di laboratorio presentate in questa Tesi e’ stata quindi la verifica dell’efficacia di tre additivi (metildietossisilano, dimetildietossisilano ed etossitrimetilsilano) nell’incrementare la nucleazione e crescita cristallina del HEWL. L’attivita’ di laboratorio e’ stata suddivisa in una prima parte di screening delle condizioni di cristallizzazione e gelificazione, e in una seconda di studio dell’effetto degli additivi. Per valutare le migliori condizioni di cristallizzazione si sono utilizzate le tecniche di Hanging Drop-Vapor Diffusion (HDVD) e di microbatch (MB) in olio, senza l’aggiunta di precursori della silice. Durante la prima fase, è stata valutata la concentrazione ottimale di TMOS per consentire una gelificazione veloce. Inoltre, sono state indagate le interazioni del gel con gli altri componenti presenti in soluzione (NaCl, NaAc, additivi). Nella seconda parte e’ stata studiata la gelificazione in gel tramite contro-diffusione (CD) utilizzando diversi set up (tubi in vetro, microcapillari, microvials per PCR). Questo metodo prevede il contatto della fase proteica gelificata con una soluzione precipitante che diffonde attraverso il gel generando un gradiente di concentrazione dinamico nello spazio e nel tempo. Esso permette quindi di visualizzare le diverse morfologie cristalline e amorfe della proteina. I risultati hanno confermato l’effetto inibitore del gel di silice su nucleazione e crescita cristallina e quindi la necessità di ridurlo tramite opportuni additivi. In generale, le prove con l’additivo dietossidimetilsilano hanno mostrato risultati ambigui e inattesi, mentre metildietossisilano e etossitrimetilsilano hanno confermato la tesi di partenza, con un effetto positivo sia sulla nucleazione che sulla qualità dei cristalli, la quale migliora all’aumentare della percentuale di additivo. Si puo’ quindi affermare che la tecnica in gel, nonostante sia complessa e richieda piu’ tempo delle tecniche di cristallizzazione alternative, rappresenta un’interessante metodologia per i futuri studi cristallografici.