Immobilizzazione dell’hLDH-A su MCM-41 per lo screening di farmaci antitumorali = hLDH-A immobilization on MCM-41 for the screening of anticancer drugs

La glicolisi aerobica è la via metabolica alterata tramite cui le cellule tumorali, a differenza di quelle normali, metabolizzano il glucosio. Nella seconda fase di questo processo, conosciuto anche come effetto Warburg, la lattato deidrogenasi (LDH) catalizza la conversione del piruvato in L-lattato in presenza di ossigeno. L’isoenzima hLDH-A viene sovraespresso in molti tumori. Dunque, la sua inibizione e, in generale quella della glicolisi aerobica, permette di ostacolare la crescita e la proliferazione delle cellule tumorali e rappresenta un punto chiave per lo sviluppo di farmaci antitumorali. Ad esempio, composti a base dei gruppi N-idrossiindoli (NHI) inibiscono l’LDH-A poiché competono con il substrato e il cofattore. Questo lavoro di tesi rappresenta l’inizio di un progetto più ampio il cui obbiettivo finale consiste nello sviluppo di un biosensore in grado di valutare l’efficacia dei farmaci antitumorali attraverso un processo rapido ed economico. Prima di tutto, sono state individuate le concentrazioni di substrato e cofattore, il pH e la temperatura dell’ambiente di reazione ideali per l’ottenimento di un’attività massima dell’enzima solubile ed è stata studiata la cinetica di conversione del piruvato in L-lattato. Successivamente, l’hLDH-A è stato immobilizzato covalentemente, con due differenti procedure, su matrici inorganiche opportunamente funzionalizzate. La silice mesoporosa MCM-41, scelta come supporto per le immobilizzazioni, è stata sottoposta a trattamenti di etero e mono-funzionalizzazione al fine di generare gruppi reattivi sulla superficie in grado di interagire con i residui amminoacidici dell’enzima. La presenza di tali gruppi sulle matrici funzionalizzate e gli effetti che questi trattamenti hanno sulla silice di partenza sono stati osservati attraverso analisi FTIR, di fisisorbimento di azoto a -196 °C e XRD. Una prima immobilizzazione è stata effettuata in presenza del 5% v/v di PEG (stabilizzante) sul supporto etero-funzionalizzato con gruppi amminici ed aldeidici (eMCM-415%PEG). La seconda, invece, è stata condotta sulla matrice mono-funzionalizzata con gruppi amminici e attivata con l’1% di glutaraldeide (mMCM-411%GA). Dal confronto di queste due immobilizzazioni, entrambe effettuate ad una temperatura compresa tra 4 °C e 10 °C, è emerso che è quella dell’hLDH-5 su eMCM-415%PEG a mostrare risultati migliori in termini di riproducibilità del processo e di attività relativa percentuale dell’enzima immobilizzato (Ract = 7,3%). Inoltre, l’effettiva presenza dell’enzima sul supporto è stata osservata con il microscopio a fluorescenza mentre prove di pH e temperatura ottimale hanno permesso di constatare un miglioramento della stabilità dell’enzima immobilizzato su eMCM-415%PEG per i pH basici compresi tra 8 e 11. Infine, sono stati effettuati test di inibizione enzimatica sulla proteina libera e su quella immobilizzata su eMCM-415%PEG utilizzando il farmaco antitumorale NHI-2.