Effetto dell'aggiunta di diversi eccipienti sulle caratteristiche termiche e biologiche di vescicole extracellulari testate in vitro = Effect of addition of different excipients on thermal and biological characteristics of extracellular vesicles tested in vitro

Tra le nanotecnologie applicate sempre con più successo in campo diagnostico e terapeutico vi sono le vescicole extracellulari (EV), strutture di origine biologica a doppio strato fosfolipidico, fondamentali nella regolazione della comunicazione intercellulare e di molti meccanismi fisiopatologici nell’organismo. I progressi nei metodi di isolamento da biofluidi e di caratterizzazione morfo-funzionale hanno permesso di ideare innovativi sistemi terapeutici nanostrutturati biocompatibili ed efficaci. I costituenti biologici delle EV, come lipidi, proteine e acidi nucleici, sono sensibili all’idrolisi e a stress meccanici e termici, che ne comprometterebbero l’attività biologica e l’efficacia terapeutica. La liofilizzazione, la disidratazione tramite sublimazione e desorbimento, consente l’ottenimento di prodotti anidri stabili nel tempo. Tuttavia, gli stress sulle biostrutture rendono necessaria l’aggiunta di eccipienti per preservare il più possibile le proprietà morfo-funzionali nel prodotto anidro o dopo ricostituzione. L’obiettivo della tesi è lo sviluppo di un processo di liofilizzazione per la conservazione di EV isolate da linfociti B umani tramite formulazioni scelte di eccipienti, tra cui PEG 10%, PEG 5% e combinazioni rispettivamente al 3%7% w/V di PEG e trealosio/saccarosio/lattosio/destrano (PD), al 3%7% w/V di glicina e trealosio /saccarosio (GS)/lattosio. Per la prima volta si è voluto studiare l’impiego come eccipienti di sostanze di derivazione biologica, come il terreno di cultura RPMI, il siero umano e il secretoma (S) di linfociti B immortalizzati. Tale scelta innovativa si basa sull’ipotesi che la loro alta concentrazione proteica protegga le EV, ottenendo un prodotto finale biocompatibile e funzionale. Tutte le formulazioni sono state caratterizzate termicamente con calorimetria a scansione differenziale e criomicroscopio per determinare la temperatura critica Tc, i cui valori sono risultati bassi per tutte le formulazioni non biologiche, tranne per PD. I liofilizzati delle formulazioni biologiche e di PD hanno una struttura omogenea e compatta, mentre le altre sono non omogenee e/o collassate. I campioni biologici hanno presentato al titolatore Karl Fisher un’umidità residua inferiore al 2%, le altre del 2-5%. I prodotti ricostituiti sono stati analizzati con il Nanoparticle Tracking Analysis per valutarne la concentrazione e le dimensioni. I campioni di EV con PD, siero umano 10%V/V e GS, presentano una concentrazione media confrontabile con quella delle EV a -80°C. I campioni con PD e PEG 10% mostrano un aumento del diametro medio, mentre quello con S 50%V/V una diminuzione, forse a causa di danni subiti durante la liofilizzazione e la reidratazione. Le altre formulazioni non presentano una variazione significativa dal valore medio. Il comportamento biologico delle EV ricostituite è stato testato in un sistema in vitro costituito da una linea cellulare sana, i linfociti B, e una tumorale, le Daudi. Le analisi di citotossicità non dimostrano una tossicità significativa in nessuna delle due linee. L’internalizzazione è migliore nei linfociti che nelle Daudi e in presenza di siero, secretoma, e PD risulta superiore agli altri eccipienti. Ciò è dato, probabilmente, dal protocollo di ricostituzione in terreno di coltura che consente un arricchimento di componenti del mezzo e la formazione di una corona proteica attorno alle EV. Il destrano probabilmente funzionalizza le EV conferendo una carica neutra, che minimizza la repulsione elettrostatica tra cellula ed EV.