Implementazione di un sistema di coltura cellulare dinamico in grado di mimare in vitro la stimolazione meccanica fisiologica della barriera alveolo-capillare = Implementation of a dynamic system to model physiological mechanical stimulation of the alveolus-capillary barrier

La barriera alveolo-capillare è una struttura in cui avvengono gli effettivi scambi di gas nei polmoni: in particolare, funge da tramite tra il comparto alveolare (contenente l’aria) e il lume capillare (ove circola il sangue) ed è costituita da tre strati: epitelio alveolare, lamina basale ed endotelio capillare. In ambito biomedico, i modelli in vitro offrono la possibilità di poter studiare e investigare più aspetti delle funzioni cellulari cercando di riprodurre un tessuto o un organo a livello fisiologico. I bioreattori consentono di effettuare colture in condizioni dinamiche e di ottenere modelli sperimentali biomimetici, abbattendo i limiti dei modelli animali e delle colture bidimensionali. L’obiettivo di questo lavoro è quello di implementare un sistema dinamico che possa ricreare le condizioni in vivo dell’ambiente della barriera alveolo-capillare, all’interno del bioreattore commerciale prodotto dall’azienda IVTech s.r.l. con camera di coltura LiveBox2 (LB2). Attraverso tale sistema è possibile mimare determinate condizioni di sovrapressione costante, quindi tutte quelle condizioni fisiologiche dove si ha un aumento locale persistente di pressione. La camera LB2 è costituita da un doppio compartimento: l’apicale mima le condizioni dell’ambiente alveolare, mentre il basale replica il lume capillare. I due compartimenti sono separati tipicamente da membrane porose commerciali. In questo lavoro di tesi è stato inizialmente ottimizzato il set up sperimentale: all’interno dell’incubatore viene posizionato il sistema completo costituito dalla camera LB2, dalla pompa peristaltica LiveFlow, dal modulatore di pressione LivePa e da un trasduttore di pressione che monitora la pressione nel tempo. Tramite l’apposito software “Digital Transducer Application” sono state effettuate e analizzate una serie di misure a partire dal sistema in condizioni statiche e con solo moto del flusso, quindi a diversi passi incrementali successivi. In questo studio sono state utilizzate inizialmente membrane in policarbonato (PC, con porosità di 0,45 μm) ottenendo dati utilizzati come calibrazione del sistema; successivamente si andranno a valutare gli effetti della sovrappressione su costrutti cellularizzati. In letteratura ed in commercio sono presenti dispositivi che tendono a non mimare le caratteristiche della barriera alveolo-capillare, poiché la semina cellulare avviene su supporti non biomimetici. In quest’ottica, emerge l’importanza di fabbricare substrati di coltura cellulare (scaffold) con caratteristiche sempre più biomimetiche che favoriscano l’adesione e la proliferazione cellulare. I risultati ottenuti nel presente lavoro di tesi saranno sfruttati per effettuare nuove prove utilizzando una membrana biomimetica elettrospinnata a base di policaprolattone (PCL) e gelatina (GL) sviluppata al Politecnico di Torino, alloggiata all’interno della camera LB2. Tale membrana consente di ottenere una matrice dalla morfologia e dalla composizione simile a quella della matrice extracellulare ed in grado di ospitare cellule. La membrana è stata caratterizzata con alcune prove preliminari nel bioreattore in condizioni statiche: viene alloggiata all’interno del bioreattore e coltivata con cellule epiteliali ed endoteliali polmonari, rispettivamente nella parte apicale e basale del sistema. L’adesione e la vitalità delle cellule all’interno del sistema è stata confermata attraverso lo staining dei nuclei e del citoscheletro.