Ricerca di un veicolo di trasfezione alternativo per il delivery di CRISPR/Cas9 = Research for an alternative transfection vehicle for CRISPR/Cas9 delivery

ABSTRACT: L’obiettivo alla base di questo lavoro di tesi è stato l’ideazione, la realizzazione e il testing di un nuovo sistema di delivery di materiale genetico attraverso l’impiego di nanoparticelle, cioè vettori ingegnerizzati con almeno una dimensione cartesiana inferiore a 100 nm: essi costituiscono il focus della ricerca ingegneristica biomedica, in quanto si pongono come uno strumento rivoluzionario applicabile non solo in ricerca, ma anche in diagnosi, in terapia e in teranostica. In particolare, in ricerca oncologica, la manipolazione genetica è imprescindibile per lo studio della patologia neoplastica in quanto consente di indagare i meccanismi di alterazione che portano alla nascita di cellule un corredo genomico mutato. In quest’ottica, la tecnologia CRISPR/Cas9 risulta rivoluzionaria in quanto consente di eseguire sia forward editing che reverse editing: la relazione tra genotipo e fenotipo, infatti, non è biunivoca e deve essere studiata in entrambi i sensi. Nei tumori del colon-retto, TCF7L2 è uno dei geni che risulta più frequentemente mutato: tuttavia, ad oggi, in letteratura, non sono presenti evidenze univoche circa il suo ruolo nell’insorgenza e nella progressione di questi tumori. Pertanto, l’obiettivo è quello di indagarne le principali forme mutazionali tramite la tecnologia CRISPR/Cas9, impiegando come modello sperimentale gli organoidi: il laboratorio di ricerca di Candiolo, infatti, dispone di un’ampia collezione di esemplari sia mutati, derivanti da cellule prelevate direttamente dai tessuti patologici di pazienti affetti dalla malattia, che wild type. Tuttavia, nonostante gli organoidi siano piattaforme di studio ideali, in quanto strutture cellulari in tre dimensioni che replicano l’organizzazione strutturale di un tessuto in modo similare a quella presente in vivo, essi risultano piuttosto difficili da manipolare: infatti, i classici metodi di trasfezione portano a risultati assolutamente insoddisfacenti in termini di efficienza. Dunque, alla luce di questa difficoltà, lo scopo ultimo di questo lavoro di tesi è stato lo studio di un approccio alternativo per la trasfezione degli organoidi basato sull’impiego di una nanoemulsione lipidica a base di DOTAP e DOPE: in prima analisi, tale piattaforma viene testata, con mero scopo esplorativo, sulla linea cellulare di adenocarcinoma del colon-retto HCT116 e paragonata con il vettore di trasfezione commerciale più impiegato, quale la Lipofectamina. Sulla base delle caratterizzazioni eseguite, in termini di morfologia, dimensione e potenziale zeta, si stabiliscono le proprietà più incisive sulla vitalità cellulare e sull’efficienza di trasfezione: nonostante tali parametri risultino in linea con i dati presenti nella lettura scientifica di settore (morfologia …, dimensione = …, potenziale zeta…), i risultati degli esperimenti biologici non sono soddisfacenti. Tale vettore, pertanto, pur non mostrando particolari effetti di tossicità nei confronti delle cellule di adenocarcinoma del colon-retto, risulta del tutto inadeguato per la trasfezione.