Sintesi e caratterizzazione di bioinchiostri a base di collagene cellularizzati con fibroblasti derivati dallo stroma della parete alveolo-capillare = Synthesis and characterization of bioinks based on cellularized collagen with fibroblasts derived from the stroma of the alveolum-capillary wall

Le malattie polmonari rappresentano una delle principali cause di morte nel mondo. Sia i modelli animali che in vitro sono utilizzati per la comprensione dello sviluppo, della fisiologia e delle patologie polmonari e per valutare l’efficienza e la tossicità dei farmaci. Tuttavia, le differenze fisiologiche tra animali e umani comportano sia dei limiti nel riprodurre tutte le caratteristiche osservate negli esseri umani, sia risposte differenti ai farmaci. Invece, i modelli in vitro sintetizzano in modo più accurato la complessità della biologia umana ed offrono ambienti cellulari strettamente controllati. Per questo motivo, l’attenzione è aumentata verso nuove tecniche di ingegneria tissutale che vengono sfruttate al fine di ottenere modelli di polmone realistici e biomimetici. Un possibile approccio è rappresentato dalla tecnica di bioprinting 3D, poiché presenta molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali, tra cui la co-stampa di materiali e cellule in una forma multistrato per creare costrutti con specifiche proprietà biochimiche, biomeccaniche e fisiologiche. Il presente lavoro di tesi ha lo scopo di realizzare un modello in vitro di polmone sfruttando la tecnica di bioprinting 3D, utilizzando come materiale per la stampa un idrogelo a base di collagene di tipo I, essendo la proteina più abbondante del tessuto polmonare. Inoltre, l’utilizzo di idrogeli a base collagene permette di ricreare un ambiente tridimensionale molto simile alla matrice extracellulare osservata in vivo, sia da un punto di vista strutturale che da un punto di vista biofunzionale. Il collagene è una proteina strutturale costituita da triple eliche che si autoassemblano secondo un processo noto come fibrillogenesi. Tale processo porta alla formazione di fibrille, che a loro volta si organizzano ulteriormente in fibre. In vitro questo fenomeno è influenzato da diversi parametri come la concentrazione di collagene, la forza ionica, il pH e la temperatura della soluzione. In questo lavoro di tesi, sono stati ottenuti idrogeli a base di collagene ad una concentrazione di 2%w/v, in cui il processo di fibrillogenesi viene indotto sfruttando il pH e la temperatura. Il fenomeno di fibrillogenesi è stato studiato inizialmente tramite il metodo della turbidità. Inoltre, per monitorare la formazione di fibrille, è stata utilizzata la spettroscopia a fluorescenza, sfruttando la Tioflavina T, un colorante fluorescente della famiglia dei benzotiazolo. Successivamente, sono stati effettuati test reologici per valutare le proprietà fisiche e meccaniche dell’idrogelo. Tuttavia, gli idrogeli presentano scarse proprietà meccaniche e scarsa stabilità in ambiente fisiologico. Per questo motivo, per migliorarne la stabilità meccanica e ridurre la velocità di degradazione, alla soluzione di collagene è stata aggiunta la riboflavina (RF), una vitamina B2 biocompatibile, usata come fotosensibilizzante per la fotoreticolazione dell’impalcatura dell’idrogel. Infine, l’idrogel è stato caricato con fibroblasti umani MRC-5 per ottenere un modello realistico di stroma della parete alveolo-capillare in vitro. Inizialmente, sono state valutate diverse densità cellulari al fine di poter scegliere la più adeguata. Attraverso, i test cell titer blue e LIVE/DEAD è stata dimostrata la vitalità delle cellule all’interno degli idrogeli di collagene. Infine, sono state eseguite delle prove preliminari di stampa che hanno dimostrato la stabilità dell’idrogelo e il suo potenziale come bioinchiostro per ottenere strutture 3D cellularizzate.