Studio sperimentale relativo alla crio-conservazione e liofilizzazione di vescicole extracellulari = Preservation of extracellular vesicles via freezing and lyophilization

Negli ultimi anni, le nanotecnologie si sono rivelate un’arma importante nell’assistere le tecniche tradizionali di diagnosi e cura in nanomedicina. Tra gli strumenti nanometrici a disposizione di ricercatori e clinici una categoria interessante è quella delle vescicole extracellulari (EV), costituite da un doppio strato fosfolipidico, secrete sia da cellule eucariotiche che procariotiche e che trasportano al loro interno carichi specifici destinati a cellule bersaglio, mediando meccanismi fisiologici e patologici. Negli ultimi anni il loro studio e ingegnerizzazione ne ha permesso un impiego sempre maggiore nella realizzazione di nuove strategie terapeutiche. Essendo nanobiomateriali, oltre all’efficientamento di metodi di isolamento e caratterizzazione, per ottenere prodotti di alta qualità servono metodi di conservazione standardizzati ed affidabili. Le macromolecole costituenti il materiale biologico e, quindi, le EV, specie se risospese in soluzione acquosa, sono sensibili agli stress ambientali e tendono a ridurre la loro efficacia terapeutica e l’attività biologica del carico trasportato. Per preservare questi prodotti in una forma anidra stabile nel tempo, la maggior parte delle tecniche per la conservazione si basa sulla disidratazione e, mentre l’essiccamento termico è deleterio per sostanze termolabili come le proteine, la liofilizzazione è molto meno stressante dal punto di vista termico. Purtroppo, anche durante questo procedimento, biomolecole quali proteine, lipidi e acidi nucleici, costituenti le EV, sono esposti a stress fisici e meccanici che impattano sulla qualità del prodotto finale. È necessario ottimizzare la liofilizzazione utilizzando formulazioni ad hoc per mantenere il più possibile le caratteristiche morfo-funzionali originali nel prodotto finale. Oggetto della tesi è stata la scelta e caratterizzazione degli eccipienti migliori come stabilizzatori per la liofilizzazione di EV isolate da linfociti B umani. Eccipienti quali saccarosio (S), trealosio (T), lattosio (L), mannitolo (M), glicina (G), destrano (D), H-&#946;-ciclodestrina (C), con concentrazione di 5% e 10% w/V, e le loro combinazioni quali T-D al 4-1%, 5-5% e 7-3%, S-D al 5-5% e 7-3%, L-D al 5-5% e 7-3%, T-D-M al 7-2-1% e T-D-G al 7-2-1%, sono stati caratterizzati con calorimetro differenziale a scansione (DSC) e criomicroscopio (FDM) per determinarne la temperatura critica, parametro fondamentale per la liofilizzazione. I risultati ottenuti da DSC e FDM hanno consentito di scartare i campioni (T-D 4-1%, T-D-M 7-2-1% e T-D-G 7-2-1%) con temperatura di transizione vetrosa troppo bassa. Gli eccipienti scelti sono stati aggiunti alle EV durante la liofilizzazione. I prodotti ricostituiti sono stati analizzati con Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) per determinarne concentrazione e dimensioni e, confrontati con i campioni non liofilizzati, individuarne eventuali cambiamenti dovuti a danni da liofilizzazione. I risultati mostrano che, senza eccipienti, le EV liofilizzate sono meno concentrate delle EV conservate a -80°C, indice di danni dovuti al processo. L’aggiunta di eccipienti prima della liofilizzazione previene il problema nel caso di L, S, M al 5%, L, S, T, D, M, G, C al 10%, LD e SD al 7-3% con una concentrazione paragonabile a quella delle EV non liofilizzate. Le soluzioni di eccipienti liofilizzati sono state analizzate con titolatore Karl Fisher e hanno mostrato una percentuale di umidità residua minore del 3% tranne nel caso dell’aggiunta di L, T e S che hanno un’umidità residua >3% ma <10%.