L'effetto della topografia e dell'ambiente tridimensionale nello sviluppo di un modello in vitro di lesione di midollo spinale: indagine sull'effetto sinergico di idrogeli e fibre allineate = The Effect of topography and 3D environment on the Development of a In Vitro Spinal Cord Injury Model: investigating the Synergic effect of Hydrogels and aligned fibers

Il sistema nervoso centrale (SNC) è una porzione del nostro organismo caratterizzato da una complessità elevata. Le patologie che lo colpiscono spesso possono portare a disabilità permanenti. In particolare, la lesione al midollo spinale (LMS) è una condizione spesso di origine traumatica che può portare a gravi impedimenti motori e una significativa perdita sensoriale, rappresentando così un problema che grava sia sui pazienti che sul sistema sanitario e la società. I modelli preclinici di LMS attualmente esistenti, nonostante il contributo significativo fornito negli anni, possiedono delle limitazioni che ostacolano ulteriori progressi per la ricerca di una terapia risolutiva. Il lavoro svolto in questo progetto di tesi consiste nello sviluppo di un modello tridimensionale (3D) in vitro di midollo spinale con rilevanza fisiologica combinando l’utilizzo di idrogeli — a base di gelatina metacrilata (GelMA) e acido ialuronico tiolato (HA-SH) — e di uno scaffold microfibroso in policaprolattone (PCL), realizzato con la tecnica del melt electrowriting (MEW). La geometria dello scaffold è stata progettata al fine di riprodurre la morfologia fibrosa e struttura anisotropa del tessuto nervoso. La scelta dei parametri è stata ottimizzata per minimizzare lo spessore dei filamenti ed aumentare la fedeltà di stampa. Gli studi in vitro sono stati condotti utilizzando una linea di astrociti umani (HASTR/ci35), selezionata in quanto gli astrociti sono coinvolti sia nei meccanismi infiammatori caratteristici del processo neurodegenerativo post traumatico, che nella formazione della cicatrice gliale nel sito di lesione. In particolare, sono state realizzate delle colture bidimensionali (2D) per studiare la risposta cellulare in presenza agenti pro-infiammatori (interleuchine 6 (IL-6) sola o in combinazione con interferone gamma (IF-γ)). In seguito, è stata performata un’analisi con tecniche di immunofluorescenza per valutare la morfologia cellulare e l’espressione proteica nelle colture 2D. Nei campioni trattati sono stati osservati sia dei cambiamenti di morfologia associati ad una maggiore densità cellulare, sia un’espressione più specifica della proteina fibrillare acida della glia (GFAP) rispetto ai controlli. Questo suggerisce che il trattamento pro-infiammatorio induce gli astrociti ad uno stato di reattività, che influenza il loro fenotipo ed il loro metabolismo. Le stesse analisi sono state performate su colture 3D con i due idrogeli presentati al fine di valutare la condizione degli astrociti in un ambiente tridimensionale, con risultati coerenti alle precedenti analisi svolte sulle colture 2D. Infine, il costrutto in PCL è stato integrato nelle colture 3D per realizzare un modello biomimetico, tramite la deposizione dei due gel cellularizzati sullo scaffold. Si è analizzata la morfologia e la distribuzione spaziale degli astrociti all’interno dei costrutti 3D al fine di valutare il contributo degli stimoli topografici indotti dallo scaffold nel miglioramento della biomimeticità del modello. Introducendo un ulteriore livello di complessità nel modello, è possibile aprire una nuova strada nella ricerca di protocolli più specifici per replicare la lesione spinale in vitro, ottenendo risultati più affidabili e riproducibili che migliorino la comprensione dei meccanismi patologici coinvolti nella lesione spinale.