Design of prototype-biotech devices for anticancer drugs targeting

Nonostante il tasso di mortalità legato all'insorgenza del cancro sia diminuito costantemente fin dall'inizio degli anni '90, esso rimane un rilevante problema di salute pubblica su scala globale, colpendo infatti, quasi il 40% della popolazione nel corso della propria vita. La sintesi di nuovi farmaci antitumorali è quindi di primaria importanza; tuttavia, il processo tradizionale per la scoperta di nuove molecole è altamente costoso e complesso. Nel presente lavoro viene presentata l'immobilizzazione della Lattato Deidrogenasi (LDH, numero di commissione enzimatica EC 1.1.1.27) su supporti di silice mesoporosa come nuova tecnica per testare in maniera rapida e riproducibile potenziali composti antitumorali, investigando la loro capacità nel diminuire l’attività enzimatica. Per individuare il supporto di immobilizzazione più adatto, sono stati testati diversi materiali: SBA-150.25, MCF0.75, DPS e DPS0.75. Essi sono funzionalizzati attraverso l’uso di due diversi organosilani, l’APTES (3-aminopropiltrietossilano) e il GPTMS (3-glicidilpropiltrimetossilano). Su ogni supporto funzionalizzato è stato quindi immobilizzato l’LDH. La spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR) è stata utilizzata per analizzare ognuno dei materiali descritti, mentre la microscopia elettronica a scansione a emissione di campo (FE-SEM) e il fisisorbimento di azoto liquido a 77K sono stati utilizzati per studiare i campioni prima e dopo la funzionalizzazione. La microscopia a fluorescenza è stata invece impiegata sui campioni di supporto funzionalizzato e su quelli con LDH. L'attività dell'enzima libero e del biocatalizzatore sintetizzato sono state misurate tramite spettrofotometro UV-vis. L'attività residua relativa del biocatalizzatore rispetto al corrispettivo libero si è rivelata variabile dal 1,7% al 7,8%. Attraverso l’analisi FTIR, è stato possibile individuare i gruppi funzionali coinvolti nel legame covalente tra la proteina e il supporto scelto. In particolare, lo spettro del materiale funzionalizzato è caratterizzato dalla presenza di un picco a numeri d’onda a 1710 cm-1, non più presente dopo l’immobilizzazione. Esso è stato associato al legame C=O, gruppo funzionale del GPTMS. Un altro picco rappresentativo è quello individuato intorno a 1600 cm-1, relativo al legame ammidico, caratteristico delle proteine ed è quindi presente solo negli spettri dei biocatalizzatori analizzati. Per valutare la maggiore resistenza dell'enzima immobilizzato rispetto alla sua forma libera, sono stati eseguiti test di attività enzimatica in presenza di diversi agenti denaturanti: solvente organico (etanolo) e una soluzione tampone a pH 10. In entrambi i casi, la forma immobilizzata di LDH ha mostrato un'attività residua finale del 40-50% superiore rispetto alla corrispondente forma libera. Sono state inoltre misurate le attività sia dei biocatalizzatori che dell’enzima nella sua forma libera, in presenza del farmaco antitumorale, l'NHI-2, un inibitore dell’isomero A dell’LDH, basato sull’ N-idrossiindolo. Lo studio cinetico della reazione ha permesso la quantificazione delle costanti cinetiche, dimostrando che l’inibitore è competitivo sia con il substrato (piruvato) dell’enzima LDH, sia con il suo cofattore (NADH). Tale competitività è stata inoltre dimostrata attraverso lo studio dell’interazione enzima-ligando con l’uso di tecniche di modellazione computazionale, tramite il software Discovery Studio.