Studio di un prototipo di biosensore mirato allo screening di farmaci antitumorali = Study of a prototype-biosensor effective for the screening of anticancer drugs

All’interno delle cellule cancerose il tasso della glicolisi aumenta in condizioni aerobiche, il che porta alla formazione di lattato come prodotto finale. Questo fenomeno è conosciuto come Effetto Warburg e la reazione chimica è catalizzata dall’isoenzima L-hLDH5 della Lattato deidrogenasi. Come conseguenza, sono stati sviluppati diversi farmaci antitumorali la cui azione si basa sull’inibizione dell’enzima LDH. L’obiettivo della presente tesi consiste nello studio del prototipo di un biosensore che, grazie ad un elemento biologico composto dalla subunità enzimatica Lattato deidrogenasi umana (hLDH-A) immobilizzata su silice mesoporosa, sia in grado di operare uno screening dei farmaci antitumorali sopracitati che agiscano come inibitori reversibili dell’enzima. Per ottenere un confronto con l’enzima immobilizzato sono stati determinati la temperatura ed il pH ottimale di operatività dell’enzima libero. La silice mesoporosa MCM-41 è stata selezionata grazie alla sua elevata area specifica ed alla presenza di silanoli che consentono il processo di funzionalizzazione post-sintesi. Sono state applicate due procedure di funzionalizzazione: una utilizzando sia GPTMS che APTES per la formazione di gruppi aldeidici ed amminici rispettivamente, ed una per ottenere un supporto mono-funzionale che presenta i soli gruppi amminici. I supporti funzionalizzati sono stati caratterizzati attraverso diverse analisi come il fisisorbimento di azoto a 77 K, XRD, FTIR e microscopia elettronica in trasmissione (HR-TEM). Sono state eseguite diverse immobilizzazioni dell’enzima su supporto eterofunzionale in presenza ed in assenza di stabilizzanti. In particolare, è stato utilizzato il PEG in diverse concentrazioni e Trealosio in concentrazione 300 mM. L’MCM-41 mono-funzionalizzato prevede uno step iniziale aggiuntivo che consiste nell’attivazione con gluteraldeide, questa è stata svolta con concentrazioni del 1 % e 2,5 % v/v. La percentuale di immobilizzazione e la Retained actvity sono state valutate per tutte le prove in modo da consentire la valutazione della tecnica di immobilizzazione più idonea e le condizioni di procedura ottimali. I risultati migliori sono stati ottenuti per LDH immobilizzato in presenza di 0,005% PEG (I=92%; RA=24,8%). Infine, sono stati eseguiti il test sulla stabilità termica, temperatura e pH ottimali per l’enzima immobilizzato, oltre ad una microscopia in fluorescenza per verificare la presenza dell’enzima sul supporto. Eseguendo uno studio teorico è emerso come un biosensore elettrochimico costituito da un elettrodo appositamente studiato, sia in grado di sfruttare la conversione redox del coenzima NAD+ a NADH svolta dall’LDH. Nell’ambiente di reazione si genera un passaggio di elettroni all’elettrodo e quindi una differenza di potenziale non nulla proporzionale alla quantità di lattato presente in soluzione. Questa può quindi fornire indicazioni sull’attività dell’enzima e sull’efficienza dell’inibitore. Per permettere questo trasferimento di elettroni sono state confrontate due strategie: un complesso di Nafion/MCM-41/LDH direttamente applicato alla superficie di un elettrodo in carbonio vitreo ed una matrice enzimatica intrappolata tra due membrane di policarbonato in serie ad un elettrodo in Pt/Nafion. Sfruttando al meglio il collocamento e le condizioni operative dell’LDH-A immobilizzato all’interno del biosensore, questo progetto risulterebbe applicabile ad una vasta gamma di farmaci antitumorali e sarebbe in grado di fornire informazioni sulla loro efficienza.