Sintesi di nanoparticelle lipidiche per veicolare RNA = Synthesis of lipid nanoparticles to deliver RNA

Le nanoparticelle lipidiche (LNPs) costituiscono una tra le più importanti classi di nanocarriers, particelle di dimensione nanometrica che, a causa di peculiari caratteristiche chimico-fisiche, sono impiegabili in campo biofarmaceutico come veicolo di principi attivi. Le nanoparticelle lipidiche, in particolare, sono utilizzate per l’incapsulamento ed il trasporto di acidi nucleici in numerose applicazioni tra cui i vaccini a mRNA contro la malattia da virus SARS-CoV-2. In questo lavoro di Tesi si è studiato il meccanismo di sintesi delle LNPs con RNA incapsulato tramite micromiscelazione. L’acido nucleico utilizzato è stato estratto da cellule di lievito Saccharomyces Cerevisiae in una fase preliminare delle attività sperimentali. Successivamente è stata eseguita la sintesi delle nanoparticelle utilizzando il microreattore Vortex mixer e queste ultime sono state caratterizzate effettuando al DLS (strumento che sfrutta la tecnica del dynamic light scattering) misurazioni in grado di fornire la distribuzione dimensionale delle particelle in sospensione, la dimensione media, l’indice di polidispersità e il potenziale zeta. Una volta effettuata la sintesi, è fondamentale l’allontanamento dell’etanolo tramite centrifugazione per preservare la stabilità delle particelle e per motivi di sicurezza legati al successivo step di liofilizzazione. È stato studiato sia l’effetto della centrifugazione sulla dimensione delle LNPs che l’efficienza di incapsulamento dell’RNA, ottenibile, tramite misure spettrofotometriche, dalla differenza di concentrazione dell’acido nucleico presente nel surnatante e di quello presente prima della sintesi. Successivamente è stata eseguita un’analisi della stabilità delle nanoparticelle lipidiche, andando a valutare l’andamento nel tempo della distribuzione dimensionale in differenti condizioni di conservazione. Inizialmente si è eseguito un confronto tra le dimensioni medie delle particelle conservate in frigo o in freezer e, in seguito, si è effettuato il confronto al variare della tipologia e della concentrazione di eccipienti crio-protettori impiegabili nello step di sintesi. In particolare, si è studiato il confronto tra formulazioni a differenti concentrazioni di saccarosio e formulazioni a differenti concentrazioni di una miscela saccarosio-mannitolo. Infine, si è effettuato uno studio relativo alle tecniche di estrazione dell’acido nucleico incapsulato nelle LNPs, in vista di un’analisi qualitativa dell’acido nucleico estratto mediante tecnica di elettroforesi su gel, operando un confronto tra l’RNA estratto da nanoparticelle fresche e quello estratto da nanoparticelle liofilizzate.