Cristallizzazione in gel di silice di lisozima e proteinasi K = Crystallization of lysozyme and proteinase K in silica gel

La cristallizzazione di proteine è utilizzata per determinare la struttura tridimensionale di tali macromolecole mediante tecniche di diffrazione oppure, in ambito farmaceutico, per somministrare e purificare i farmaci. La completa comprensione e il controllo del processo sono questioni complicate in quanto i cristalli di proteina sono fragili e le macromolecole impiegate sono estremamente sensibili alla denaturazione. Perciò, finora, il trial-and-error rappresenta l’approccio principalmente impiegato. In questo lavoro di tesi, due proteine modello, lisozima e proteinasi K, sono state cristallizzate, utilizzando precipitanti (per salting out), mediante diverse tecniche: microbatch, hanging drop-vapor diffusion, contro-diffusione e batch in gel di silice. Attraverso le prime due metodologie sono state identificate delle concentrazioni di proteina e precipitante per cui avvenisse la nucleazione, che successivamente sono state sfruttate come punto di partenza per la cristallizzazione in gel di silice. Tale gel consente di ottenere cristalli di buona qualità, eliminando la convezione durante la fase di crescita, ma ha lo svantaggio di esercitare un effetto inibitivo sulla nucleazione, dovuto alle interazioni tra gel e proteina. Allo scopo di limitare tale effetto, la cristallizzazione in gel di silice di lisozima e proteinasi K è stata condotta utilizzando tre additivi, metildietossisilano, dimetildietossisilano e trimetiletossisilano, i quali, sostituendo gruppi metilici ad alcuni -SiOH del gel, riducono la quantità di proteina legata al gel, promuovendone la nucleazione.